Змийската отрова съдържа ензими, които хидролизират карбоксилните естерни връзки.Субстратите за хидролиза са фосфолипиди, ацетилхолин и ароматен ацетат.Тези ензими включват три вида: фосфолипаза, ацетилхолинестераза и ароматна естераза.Аргинин естеразата в змийската отрова може също да хидролизира синтетичен аргинин или лизин, но основно хидролизира протеинови пептидни връзки в природата, така че принадлежи към протеазата.Обсъжданите тук ензими действат само върху естерни субстрати и не могат да действат върху пептидна връзка.Сред тези ензими биологичните функции на ацетилхолинестеразата и фосфолипазата са по-важни и са напълно проучени.Някои змийски отрови имат силна ароматна естеразна активност, която може да хидролизира p-нитрофенил етилов естер, a- или P-нафтален ацетат и индол етилов естер.Все още не е известно дали тази активност се произвежда от независим ензим или известен страничен ефект на карбоксилестеразата, да не говорим за нейното биологично значение.Когато отровата на Agkistrodon halys Japonicus реагира с р-нитрофенил етилов естер и индол етилов естер, хидролизатите на р-нитрофенол и индол фенол не са открити;Напротив, ако тези естери реагират със змийската отрова от подвида на кобра Zhoushan и змийската отрова на Bungarus multicinctus, те бързо ще бъдат хидролизирани.Известно е, че тези отрови на кобра имат силна холинестеразна активност, която може да е отговорна за хидролизата на горните субстрати.Всъщност Mclean et al.(1971) съобщава, че много змийски отрови, принадлежащи към семейство Cobra, могат да хидролизират индол етилов естер, нафталин етилов естер и бутил нафталин естер.Тези змийски отрови идват от: кобра, черноврата кобра, черноуста кобра, златна кобра, египетска кобра, кралска кобра, златна кобра мамба, черна мамба и бялоуста мамба (D. aw все още познава източната ромболова гърмяща змия
Змийската отрова може да хидролизира метил индол етилов естер, който е субстрат за определяне на холинестеразната активност в серума, но тази змийска отрова не показва холинестеразна активност.Това показва, че има неизвестна естераза в отровата на кобрата, която е различна от холинестеразата.За да се разбере природата на този ензим, е необходима допълнителна работа по разделяне.
1、 Фосфолипаза А2
(I) Преглед
Фосфолипазата е ензим, който може да хидролизира глицерил фосфат.В природата има 5 вида фосфолипаза, а именно фосфолипаза А2 и фосфолипаза
A. , фосфолипаза B, фосфолипаза C и фосфолипаза D. Змийската отрова съдържа главно фосфолипаза A2 (PLA2), няколко змийски отрови съдържат фосфолипаза B, а други фосфолипази се намират главно в животински тъкани и бактерии.Фигура 3-11-4 показва мястото на действие на тези фосфолипази върху хидролизата на субстрата.
Сред фосфолипазите, PLA2 е проучен повече.Може да е най-изследваният ензим в змийската отрова.Неговият субстрат е естерната връзка на втората позиция на Sn-3-глицерофосфата.Този ензим се среща широко в змийска отрова, пчелна отрова, отрова от скорпион и животински тъкани, а PLA2 е в изобилие в четири змийски отрови от семейството.Тъй като този ензим разгражда червените кръвни клетки и причинява хемолиза, той се нарича още „хемолизин“.Някои хора също наричат PLA2 хемолитична лецитиназа.
Ludeeke за първи път установи, че змийската отрова може да произведе хемолитично съединение, като действа върху лецитина чрез ензими.По-късно Delezenne et al.доказа, че когато отровата на кобра действа върху конски серум или жълтък, тя образува хемолитично вещество.Сега е известно, че PLA2 може директно да действа върху фосфолипидите на еритроцитната мембрана, разрушавайки структурата на еритроцитната мембрана и причинявайки директна хемолиза;Той може също така да действа върху серума или добавения лецитин, за да произведе хемолитичен лецитин, който действа върху червените кръвни клетки, за да предизвика индиректна хемолиза.Въпреки че PLA2 е в изобилие в четирите семейства змийски отрови, съдържанието на ензими в различните змийски отрови е малко по-различно.Гърмяща змия (C
Змийската отрова показва само слаба PLA2 активност.Таблица 3-11-11 илюстрира сравнението на активността на PLA2 на 10 основни отрови на отровни змии в Китай.
Таблица 3-11-11 Сравнение на активността на фосфолипаза VIII на 10 змийски отрови в Китай
Змийска отрова
Освобождаване на мазнини
алифатна киселина,
Cjumol/mg)
Хемолитична активност CHU50/^ g * ml)
Змийска отрова
Освободете мастни киселини
(^raol/mg)
Хемолитична активност“ (HU50/ftg * 1111)
Наджанаджа атра
9. 62
единадесет
Микрацефален офис
пет точка едно нула
kalyspallas
8. 68
две хиляди и осемстотин
gracilis
V, остър
7. 56
* * #
Офиофаг Хана
три точка осем две
сто и четиридесет
Bnugarus fasctatus
7,56
двеста и осемдесет
B. multicinctus
едно точка девет шест
двеста и осемдесет
Viper a Russelli
седем точка нула три
T, mucrosquamatus
едно точка осем пет
Сименсис
T. stejnegeri
0. 97
（2） Разделяне и пречистване
Съдържанието на PLA2 в змийската отрова е голямо и е стабилно на топлина, киселина, основа и денатурант, така че лесно се пречиства и отделя PLA2.Общият метод е първо да се извърши гел филтрация върху суровата отрова, след това да се извърши йонообменна хроматография и следващата стъпка може да се повтори.Трябва да се отбележи, че лиофилизацията на PLA2 след йонообменна хроматография не трябва да причинява агрегация, тъй като процесът на лиофилизация често увеличава йонната сила в системата, което е важен фактор, причиняващ агрегация на PLA2.В допълнение към горните общи методи са приети и следните методи: ① Wells et al.② Субстратният аналог на PLA2 се използва като лиганд за афинитетна хроматография.Този лиганд може да се свързва с PLA2 в змийска отрова с Ca2+.EDTA се използва най-вече като елуент.След като Ca2+ се отстрани, афинитетът между PLA2 и лиганда намалява и той може да бъде дисоцииран от лиганда.Други използват 30% органичен разтвор или 6 mol/L урея като елуент.③ Беше извършена хидрофобна хроматография с PheiiylSephar0SeCL-4B за отстраняване на следи от PLA2 в кардиотоксин.④ Анти PLA2 антитяло се използва като лиганд за извършване на афинитетна хроматография върху PLA2.
Досега са пречистени голям брой змийска отрова PLAZ.Tu et al.(1977) изброява PLA2, пречистен от змийска отрова преди 1975 г. През последните години всяка година се съобщава за голям брой статии за отделяне и пречистване на PLA2.Тук се фокусираме върху отделянето и пречистването на PLA от китайски учени.
Chen Yuancong и др.(1981) отделят три вида PLA2 от отровата на Agkistrodon halys Pallas в Zhejiang, които могат да бъдат разделени на киселинни, неутрални и алкални PLA2 според техните изоелектрични точки.Според неговата токсичност неутралния PLA2 е по-токсичен, който е идентифициран като пресинаптичен невротоксин Agkistrodotoxin.Алкалният PLA2 е по-малко токсичен, а киселинният PLA2 няма почти никаква токсичност.Wu Xiangfu и др.(1984) сравняват характеристиките на три PLA2, включително молекулно тегло, аминокиселинен състав, N-терминал, изоелектрична точка, термична стабилност, ензимна активност, токсичност и хемолитична активност.Резултатите показват, че те имат сходно молекулно тегло и термична стабилност, но имат значителни разлики в други аспекти.От гледна точка на ензимната активност киселинната ензимна активност е по-висока от алкалната ензимна активност;Хемолитичният ефект на алкалния ензим върху червените кръвни клетки на плъхове е най-силен, следван от неутралния ензим и киселинния ензим, който е трудно хемолизиран.Следователно се спекулира, че хемолитичният ефект на PLAZ е свързан със заряда на PLA2 молекулата.Zhang Jingkang и др.(1981) са направили кристали Agkistrodotoxin.Tu Guangliang и др.(1983) съобщават, че токсичен PLA с изоелектрична точка 7.6 е изолиран и пречистен от отровата на Vipera rotundus от Фуджиан и неговите физични и химични свойства, аминокиселинен състав и последователността от 22 аминокиселинни остатъка при N -терминал бяха определени.Li Yuesheng и др.(1985) изолират и пречистват друг PLA2 от отровата на Viper rotundus във Фуджиан.Субединицата на PLA2 * е 13 800, изоелектричната точка е 10,4, а специфичната активност е 35/xnioI/miri mg。 С лецитин като субстрат оптималното pH на ензима е 8,0 и оптималната температура е 65 °C LD5, инжектиран интравенозно в мишки.Тя е 0,5 ± 0,12 mg/kg.Този ензим има очевидни антикоагулантни и хемолитични ефекти.Токсичната молекула PLA2 се състои от 123 остатъка от 18 вида аминокиселини.Молекулата е богата на цистеин (14), аспарагинова киселина (14) и глицин (12), но съдържа само един метионин, а нейният N-терминал е серинов остатък.В сравнение с PLA2, изолиран от Tuguang, молекулното тегло и броят на аминокиселинните остатъци на двата изоензима са много сходни и аминокиселинният състав също е много подобен, но броят на аспарагиновата киселина и пролиновите остатъци е малко по-различен.Змийската отрова на кралската кобра в Гуанси съдържа богат PLA2.Shu Yuyan и др.(1989) изолират PLA2 от отровата, която има специфична активност 3,6 пъти по-висока от оригиналната отрова, молекулно тегло 13000, състав от 122 аминокиселинни остатъка, изоелектрична точка 8,9 и добра термична стабилност.От наблюдението с електронен микроскоп на ефекта на основния PLA2 върху червените кръвни клетки може да се види, че той има очевиден ефект върху мембраната на човешките червени кръвни клетки, но няма очевиден ефект върху червените кръвни клетки на козите.Този PLA2 има очевиден ефект на забавяне на електрофоретичната скорост на червените кръвни клетки при хора, кози, зайци и морски свинчета.Чен и др.Този ензим може да инхибира тромбоцитната агрегация, предизвикана от ADP, колаген и натриева арахидонова киселина.Когато концентрацията на PLA2 е 10/xg/ml ~ 100 jug/ml, тромбоцитната агрегация е напълно инхибирана.Ако като материали се използват промити тромбоцити, PLA2 не може да инхибира агрегацията при концентрация от 20 Mg/ml.Аспиринът е инхибитор на циклооксигеназата, който може да инхибира ефекта на PLA2 върху тромбоцитите.PLA2 може да инхибира тромбоцитната агрегация чрез хидролизиране на арахидонова киселина за синтезиране на тромбоксан А2.Конформацията на разтвора на PLA2, произведена от отровата на Agkistrodon halys Pallas в провинция Zhejiang, е изследвана чрез кръгов дихроизъм, флуоресценция и UV абсорбция.Експерименталните резултати показват, че конформацията на основната верига на този ензим е подобна на тази на същия вид ензим от други видове и родове, конформацията на скелета има добра устойчивост на топлина и структурната промяна в киселата среда е обратима.Комбинацията от активатор Ca2+ и ензим не влияе върху средата на триптофановите остатъци, докато инхибиторът Zn2+ прави обратното.Начинът, по който pH стойността на разтвора влияе върху ензимната активност, е различен от горните реагенти.
В процеса на пречистване на PLA2 на змийска отрова, очевидно явление е, че змийската отрова съдържа два или повече пика на елуиране на PLA2.Това явление може да се обясни по следния начин: ① поради наличието на изоензими;② Един вид PLA2 се полимеризира в различни смеси на PLA2 с различни молекулни тегла, повечето от които са в диапазона от 9 000~40 000;③ Комбинацията от PLA2 и други компоненти на змийска отрова усложнява PLA2;④ Тъй като амидната връзка в PLA2 е хидролизирана, зарядът се променя.① И ② са често срещани, само с няколко изключения, като PLA2 в CrWa/w змийска отрова
Има две ситуации: ① и ②.Третото условие е открито в PLA2 в отровата на следните змии: Oxyranus scutellatus, Parademansia microlepidota, Bothrops a ^>er, палестинска усойница, пясъчна усойница и ужасна гърмяща змия km。
Резултатът от случай ④ кара скоростта на миграция на PLA2 да се променя по време на електрофореза, но аминокиселинният състав не се променя.Пептидите могат да бъдат разбити чрез хидролиза, но обикновено те все още са свързани заедно чрез дисулфидни връзки.Отровата на източната гърмяща змия съдържа две форми на PLA2, наречени съответно тип a и тип p PLA2.Разликата между тези два вида PLA2 е само една аминокиселина, т.е. глутаминът в една молекула PLA2 е заменен от глутаминова киселина в другата молекула PLA2.Въпреки че точната причина за тази разлика не е ясна, обикновено се смята, че тя е свързана с дезаминирането на PLA2.Ако PLA2 в отровата на палестинската усойница се поддържа топъл със суровата отрова, крайните групи в неговите ензимни молекули ще станат повече от преди.От C PLA2, изолиран от змийска отрова, има два различни N-терминала и неговото молекулно тегло е 30 000. Това явление може да бъде причинено от асиметричния димер на PLA2, който е подобен на симетричния димер, образуван от PLA2 в отровата на източната диамантена гърмяща змия и западна диамантена гърмяща змия.Азиатската кобра се състои от много подвидове, някои от които не са много категорични като класификация.Например, това, което се наричаше външнокаспийски подвид Cobra, сега е признато
Трябва да се припише на външната кобра от Каспийско море.Тъй като има много подвидове и те се смесват заедно, съставът на змийската отрова варира значително поради различните източници, а съдържанието на PLA2 изоензими също е високо.Например отровата на кобрата
Бяха открити най-малко 9 вида PLA2 изоензими на видовете r ^ ll и 7 вида PLA2 изозими бяха открити в отровата на подвида кобра Caspian.Дъркин и др.(1981) изследва съдържанието на PLA2 и броя на изоензимите в различни змийски отрови, включително 18 отрови на кобра, 3 отрови на мамба, 5 отрови на усойница, 16 отрови на гърмяща змия и 3 отрови на морски змии.Като цяло PLA2 активността на отровата на кобрата е висока, с много изоензими.PLA2 активността и изоензимите на отровата на усойница са средни.PLA2 активността на отровата на мамба и отровата на гърмяща змия е много ниска или никаква PLA2 активност.PLA2 активността на отровата на морска змия също е ниска.
През последните години не е докладвано, че PLA2 в змийската отрова съществува под формата на активен димер, като източната ромбофорна гърмяща змия (C. змийската отрова съдържа тип a и тип P PLA2, като и двете са съставени от две идентични субединици , а само димеразата има
Дейност.Шен и др.също предполага, че само димерът на PLA2 на змийската отрова е активната форма на ензима.Изследването на пространствената структура също доказва, че PLA2 на западната диамантена гърмяща змия съществува под формата на димер.Рибоядно съединение
Има две различни PLA ^ Ei и E2 от змийска отрова, в които 仏 съществува под формата на димер, димерът е активен, а неговият дисоцииран мономер е неактивен.Lu Yinghua и др.(1980) допълнително изследва физичните и химичните свойства и кинетиката на реакцията на E. Jayanthi et al.(1989) изолира основен PLA2 (VRVPL-V) от отровата на усойница.Молекулното тегло на мономера PLA2 е 10000, който има смъртоносни, антикоагулантни и едемни ефекти.Ензимът може да полимеризира полимери с различни молекулни тегла при условие на PH 4.8, а степента на полимеризация и молекулното тегло на полимерите се увеличават с повишаване на температурата.Молекулното тегло на полимера, генериран при 96 ° C, е 53 100, а PLA2 активността на този полимер се увеличава с две
Време на публикуване: 18 ноември 2022 г